د فاسټ کینګ RT کټ (د gDNase سره)

A-1 RNA تخریب شوی

د لوړ کیفیت لرونکي RNA پاک کړئ پرته له ککړتیا سره. هغه مواد چې له هغه څخه RNA ایستل کیږي باید د امکان تر حده تازه وي ترڅو د RNA تخریب مخه ونیسي. د RT عکس العمل دمخه په تخریب شوي جیل کې د RNA بشپړتیا تحلیل کړئ. د RNA استخراج وروسته ، دا باید په 100 for فارمیامایډ کې زیرمه شي. که د RNase مخنیوی کونکي وکارول شي ، د تودوخې تودوخه باید <45 ° C وي ، او pH باید له 8.0 څخه کم وي ، که نه نو مخنیوی کونکی به ټول محدود RNase خوشې کړي. سربیره پردې ، د RNase مخنیوی کونکی باید په حلونو کې اضافه شي چې ≥ 0.8 mM DTT لري.

A-2 RNA د بیرته راګرځیدونکي عکس العملونو مخنیوی کونکي لري

د ریورس ټرانسکرپشن انابیټرز شامل دي SDS ، EDTA ، ګلیسرول ، سوډیم پیروفاسفیت ، سپرمیډین ، فارامایډ ، ګانیډین مالګه ، او نور. د کنټرول RNA د نمونې سره ګډ کړئ ، او حاصل د کنټرول RNA عکس العمل سره پرتله کړئ ترڅو وګوري چې ایا یو منع کونکی شتون لري. د RNA باران د 70 ((v/v) ایتانول سره د مخنیوی کونکو لرې کولو لپاره ومینځئ.

A-3 د پریمرونو ناکافي انیلینګ د cDNA لومړي سټنډ ترکیب کولو لپاره کارول کیږي

مشخص کړئ چې د انیلینګ تودوخه د پریمرونو لپاره مناسبه ده چې په تجربه کې کارول کیږي. د تصادفي هیکسامرونو لپاره ، سپارښتنه کیږي چې د عکس العمل تودوخې ته رسیدو دمخه د 10 دقیقو لپاره تودوخه 25 ° C کې وساتئ. د جین ځانګړي پریمرونو (GSP) لپاره ، نور GSP هڅه وکړئ ، یا اولګو (dT) یا تصادفي هیکسامر ته واړوئ.

A-4 د RNA پیل کولو کوچنۍ اندازه

- د RNA اندازه زیاته کړئ. د RNA نمونو لپاره چې له 50 ng څخه کم وي ، له 0.1 μg څخه تر 0.5 μg اسیتیل BSA د لومړي سټراین cDNA ترکیب کې کارول کیدی شي

A-5 د هدف ترتیب په تحلیل شوي نسجونو کې نه څرګندیږي.

- د نورو نسجونو هڅه وکړئ.

د A-6 PCR غبرګون ناکام شو

د دوه مرحلو RT-PCR لپاره ، د PCR مرحله کې د CDNA ټیمپلیټ د عکس العمل حجم 1/5 څخه ډیر نشي کیدی.

A-1 د پریمرونو او ټیمپلیټونو غیر مشخص انیلینګ

د پریمرونو 3'پای باید 2-3 DG یا DC ونه ولري. د تصادفي پریمر یا اولیګو (dT) پرځای د لومړي سټینډ ترکیب کې د جین ځانګړي پریمر وکاروئ. په لومړي څو دورو کې د لوړ انیلینګ تودوخې وکاروئ ، او بیا د ټیټ انیلینګ تودوخه. د PCR لپاره د ګرم پیل ټیک DNA پولیمریز وکاروئ ترڅو د عکس العمل ځانګړتیا ښه کړي.

A-2 د جین ځانګړي پریمر ضعیف ډیزاین

- د پریمپر ډیزاین لوړولو لپاره ورته اصول تعقیب کړئ.

A-3 RNA د جینومیک DNA سره ککړ شوی

د PCR درجې DNase I سره RNA درملنه وکړئ

A-4 د پریمر ډیمر جوړول

د 3 'پای کې پرته له تکمیل تسلسل څخه ډیزاین پریمر.

A-5 ډیر لوړ Mg²⁺ تمرکز

pt غوره کول Mg²⁺ د هر ټیمپلیټ او پریمر ترکیب لپاره تمرکز

A-6 د بهرني DNA سره ککړ شوی

د ایروسول مقاومت لرونکي لارښوونې او د UDG انزیمونه وکاروئ.

A-1 د لومړي سټراین محصول مینځپانګه خورا لوړه ده

- په دودیز PCR غبرګون مرحله کې د لومړي سټراین محصول مقدار کم کړئ.

A-2 د PCR عکس العمل کې خورا لوړ مقدار

د پریمر ننوتل کم کړئ.

A-3 ډیرې دورې

د PCR عکس العمل شرایط غوره کړئ او د PCR دورې شمیره کم کړئ.

A-4 خورا ټیټ انیلینګ تودوخه

-د غیر مشخص پیل او توسعې مخنیوي لپاره د انیلینګ حرارت لوړ کړئ.

A-5 د اولیګونوکلیوټایډ ټوټو غیر مشخص توضیح کول د DNase تخریب لخوا رامینځته شوي-د لوړ کیفیت لرونکي RNA استخراج کول ترڅو د DNA ککړتیا مخه ونیسي.

RT-PCR دا دی چې د RNA نقل په cDNA بدل کړي ، او بیا د PCR عکس العمل لپاره د ریورس ټرانسکرپټ cDNA د هدف ټوټې پراخولو لپاره وکاروئ. د تجربې ځانګړي شرایطو سره سم یا هم تصادفي پریمر ، اولیګو dT او د جین ځانګړي پریمر غوره کړئ. ټول پورتني پریمرونه د ویښتو نخاعي جوړښت پرته د لنډ یوکاریوټیک سیل mRNA لپاره کارول کیدی شي.

تصادفي پریمر: د اوږدو RNA لپاره مناسب د ویښتو پوټکي جوړښت سره ، په بیله بیا د RNA هر ډول لکه rRNA ، mRNA ، tRNA ، او نور. دا اساسا د واحد ټیمپلیټ RT-PCR عکس العمل لپاره کارول کیږي.

Oligo dT: د PolyA دمې سره د RNA لپاره مناسب (پروکاریوټیک RNA ، eukaryotic Oligo dT rRNA او tRNA د PolyA دمې نلري). ځکه چې اولیګو dT د پولیا دم پورې تړلی دی ، د RNA نمونو کیفیت لوړ کیدو ته اړتیا ده ، او حتی د تخریب یوه کوچنۍ اندازه به د بشپړ اوږدوالي cDNA ترکیب مقدار خورا کم کړي.

د جین ځانګړي پریمر: د ټیمپلیټ تسلسل تکمیل کونکی ، د شرایطو لپاره مناسب چیرې چې د هدف ترتیب پیژندل کیږي.

دوه لارې شتون لري:

1. د داخلي حوالې میتود: په تیوري کې ، cDNA د مختلف اوږدوالي DNA ټوټې دي ، نو د الیکروفوریسس پایله سمیر دی. که د RNA کثرت ټیټ وي ، هیڅ محصول به په الیکټروفورسیس کې ونه ښودل شي ، مګر دا پدې معنی ندي چې هیڅ محصول به د PCR لخوا پراخه نشي. په عموم کې ، داخلي حواله د cDNA کشف کولو لپاره کارول کیدی شي. که داخلي حواله پایلې ولري ، د cDNA کیفیت اساسا تضمین کیدی شي (په ځینې قضیو کې ، که د هدف جین ټوټه ډیره اوږده وي ، نو استثناوې شتون لري).

2. که چیرې د دې نمونې لخوا پیژندل شوی جین شتون ولري ، دا د دې جین لومړیو لخوا تایید کیدی شي. د داخلي حوالې پراخه کول د دې معنی نلري چې د cDNA سره کومه ستونزه شتون نلري. ځکه چې داخلي حواله په cDNA کې لوړ کثرت لري ، دا پراخه کول اسانه دي. که چیرې CDNA د مختلف دلایلو له مخې یو څه تخریب شي ، د احتمال له نظره ، د ټیټ کثرت هدف جینونو PCR پایلې به خورا ډیر اغیزمن شي. پداسې حال کې چې داخلي حواله لاهم په کافي اندازه لوړه ده ، پراخول به شاید اغیزمن نشي.

د RNA یو څه تخریب. د RNA بشپړتیا کشف او پاک کړئ

د مختلف ډولونو RNA مینځپانګې ممکن مختلف وي ، مګر په عموم کې ، استخراج شوي ټول RNA باید دوه روښانه 28S او 18S بینډونه په جیل الیکټروفورسس کې ولري ، او د پخواني بینډ روښانتیا باید د وروستي په پرتله دوه چنده لوړه وي. د 5S بینډ په ګوته کوي چې RNA تخریب شوی ، او د هغې روښانتیا د تخریب درجې سره متناسب ده. د داخلي حوالې بریالي توسع کول پدې معنی ندي چې د RNA سره کومه ستونزه شتون نلري ، ځکه چې داخلي حواله په لوړه کثرت کې ده ، RNA تر هغه وخته پراخیدلی شي ترڅو چې تخریب سخت نه وي. د OD₂₆₀/OD₂₈₀د سپیکروفوټومیټر لخوا اندازه شوي خالص RNA تناسب باید د 1.9 او 2.1 ترمینځ وي. په RNA کې د پروټین ناپاکۍ لږه اندازه به تناسب کم کړي. تر هغه چې ارزښت خورا ټیټ نه وي ، RT به اغیزمن نشي. هغه څه چې د RT لپاره خورا مهم دي د RNA بشپړتیا ده.

د داخلي حوالې جین غزول یوازې دا په ګوته کولی شي چې RT بریالی شوی ، مګر دا لازمي ندي د cDNA سټنډ کیفیت سره تړاو لري. ځکه چې د داخلي حوالې ټوټې عموما د اندازې کوچنۍ او د بیان لوړه وي ، دا د بیرته لیږد کې بریالي کیدل اسانه دي. په هرصورت ، د هدف جین اندازه او بیان له جین څخه تر جین پورې توپیر لري. د cDNA کیفیت یوازې د داخلي حوالې په واسطه قضاوت کیدی نشي په ځانګړي توګه د هدف کڅوړو لپاره چې له 2 kb څخه ډیر اوږد وي.

ځینې ​​نمونې پیچلي ثانوي جوړښتونه لري ، یا د GC بډایه مینځپانګه لري ، یا د ټیټ کثرت سره قیمتي دي. پدې قضیو کې ، مناسب ریورس ټرانسکرپټیس باید د هدف ټوټې اندازې او نمونې مطابق وټاکل شي. د لوړ GC مینځپانګې او پیچلي ثانوي جوړښت سره د RNA ټیمپلیټونو لپاره ، په ټیټ تودوخې کې د ثانوي جوړښت خلاصول مشکل دي ، یا د عام ریورس ټرانسکرپټیس سره. د دې ټیمپلیټونو لپاره ، د کوانټ ریورس ټرانسکرپټیس غوره کیدی شي ، ځکه چې د دې ریورس ټرانسکرپټ فعالیت په څرګند ډول د M-MLV لړۍ ریورس ټرانسکرپټیس څخه غوره دی ، کوم چې کولی شي د RNA مختلف ټیمپلیټونه په مؤثره توګه نقل کړي او RNA اعظمي حد ته cDNA لومړي سټراینډ کې نقل کړي. کله چې د عمومي ریورس ټرانسکرپټیس کټ وکاروئ ، 20 μl سیسټم کولی شي یوازې په مؤثره توګه د ټول RNA 1 μg نقل کړي. مهرباني وکړئ د کټ اعظمي RT ظرفیت ته پاملرنه وکړئ. که سانچه په اضافي ډول اضافه شي ، ریورس ټرانسکرپشن به د لوړ کثرت سره RNA سره مرسته وکړي. له همدې امله ، دا غوره ده چې د سیسټم اعظمي ظرفیت څخه تجاوز ونکړئ.

A-1 مشخص کړئ که RNA په جدي ډول تخریب شوی وي او که RT بریالی وي

په عموم کې ، د داخلي حوالې پراخېدو د ناکامۍ دلیل اکثرا د جدي RNA تخریب له امله رامینځته کیږي. بل ممکنه دلیل یې د نقل نقل ناکامي ده. داخلي حواله د cDNA واحد سټنډ کیفیت قضاوت لپاره د معیار په توګه نشي کارول کیدی ، مګر دا د معیار په توګه کارول کیدی شي ترڅو قضاوت وکړي چې ایا د RNA کیفیت کومه ستونزه شتون نلري ریورس ټرانسکرپشن بریالی دی. د بیرته راګرځولو پروسې کې ترټولو مهم شی د عکس العمل موثریت ښه کولو لپاره د ثابت حرارت او ثابت عکس العمل سیسټم ساتل دي.

A-2 مشخص کړئ چې ایا د داخلي حوالې جینونو پراخولو لپاره پریمر د باور وړ دي او که په PCR کې کارول شوي ری ایجنټونو سره کومه ستونزه شتون لري.

د نسبي اندازې لپاره ، RNA باید د ریورس ټرانسکرپشن دمخه اندازه شي ، کوم چې په ډیری ریورس ټرانسکرپشن کټونو کې هم اړین دی ، د مثال په توګه ، د RNA انډول د 1 μg په توګه اندازه کړئ. لدې چې بیرته لیکل شوی cDNA یو مخلوط حل دی ، پشمول د RNA ، oligo dT ، انزایم ، dNTP ، او حتی د DNA یو څه پاتې شونی ، انحراف به رامینځته شي ، نو د CDNA دقیق اندازه کول ناممکن دي. له همدې امله ، د RNA اندازه کول اړین دي. د ریورس ټرانسکرپشن موثریت په پام کې نیولو سره د مختلف نمونو ترمینځ ورته دی ، د ترلاسه شوي cDNA اندازه باید ورته وي ، او کمیتي تحلیل کولی شي د ټول RNA په ورته مقدار کې د مختلف جینونو بیان کچې پرتله کول وښیې. کله چې د نسبي فلوروسینس کمیتي PCR ترسره کوئ ، د بیرته راګرځیدو وروسته کمیتي cDNA ته اړتیا نشته ځکه چې داخلي حواله جین د حوالې په توګه عمل کیدی شي.

دا اساسا په جینونو پورې اړه لري ، او د اوږدې ټوټې ریورس نقل د ډیری جینونو لپاره امکان نلري. لومړی ، د ریورس ټرانسکرپشن موثریت د PCR په پرتله خورا ټیټ دی. دوهم ، د GC بډایه سیمه او د ډیری جینونو ثانوي جوړښت دواړه ریورس ټرانسکرپشن او PCR محدودوي. په نهایت کې ، د PCR وفادارۍ او پراخولو موثریت په ورته وخت کې تضمین کول مشکل دي. د ریورس ټرانسکرپشن په پروسه کې ، هیڅ څوک نشي کولی د ټیټ کاپي جینونو لپاره د اوږدې ټوټې ترلاسه کولو تضمین وکړي ، په ځانګړي توګه د اولیګو ډی ټي کارول. لکه څنګه چې د ډیر GC سره 5 'UTR ، دا حتی خورا ستونزمن دی. له همدې امله ، دا لاهم یو مناسب میتود دی چې د تصادفي پریمرونو سره نقل نقل کړئ ، په هدف ټوټه کې د طبیعي پاکیدو سایټونه ومومئ ، د برخو په واسطه پراخه کړئ ، او بیا د هضم او لیګیشن محدودیت ترسره کړئ. په عموم کې ، دا ستونزمنه ده چې مستقیم د 2 kb څخه لویې ټوټې پراخه کړئ ، مګر دا ترلاسه کول تل ناممکن ندي: 1. لومړی له هرڅه څخه ، د RNA/mRNA بشپړتیا تضمین کړئ ، او د TRIZOL استخراج غوره دی. 2.M-MLV RT-PCR کټ مستقیم کارول کیدی شي. د انیل کولو وخت غځول او د سپړلو پروسې کې د دورې شمیره په سمه توګه لوړول. په بدیل توګه ، ځړول شوی PCR پلي کیدی شي ، یا یو یا دوه عکس العملونه ترسره کیدی شي لومړی د مناسب PCR پراخیدو دمخه د مناسب توسیع شوي توزیع او توسیع وخت سره ، کوم چې ممکن د ټوټو غزولو کې مرسته وکړي. د پولیمریز وفادارۍ ته پاملرنه وکړئ. 3. لانگ طاق په PCR کې د مثالي پایلو ترلاسه کولو لپاره کارول کیدی شي. 4. د پروټین بیان غوښتنلیک لپاره ، لوړ مخلص پولیمریز باید پلي شي.

دلته دوه ډوله ریورس ټرانسکرپټیس شتون لري چې د TIANGEN لخوا وړاندیز کیږي: کوانټ/کینګ RTase او TIANScript M-MLV. د دوی ترمینځ اصلي توپیر د ټیمپلیټونو داخل مقدار دی. کوانټ یو ځانګړی ریورس ټرانسکرپټیس دی ، کوم چې د عام استعمال شوي M-MLV څخه توپیر لري چې د مولوني مورین لیوکیمیا ویروس څخه اخیستل شوی. کوانټ د نوي لوړ موثریت ریورس ټرانسکرپټیس دی چې په دوه ځله د انجینرۍ ایسچریچیا کولی لخوا څرګند شوی. کوانټ د 50 Ng-2 Rg RNA لوړولو لپاره مناسب دی د لوړ ریورس ټرانسکرپشن فعالیت او لوړ حاصل سره. د عادي MMLV یا AMV سره پرتله کول ، د کوانټ ترټولو لوی ځانګړتیا دا ده چې دا د RNA ټیمپلیټونو سره خورا قوي تړاو لري او کولی شي د لوړې تودوخې تخفیف پرته د لیږد پیچلي ټیمپلیټونه بیرته راوباسي. د لوړ GC مینځپانګې لرونکي ټیمپلیټونو لپاره ، برعکس موثریت لوړ دی. په هرصورت ، دا ریورس ټرانسکرپټیس د RNase H فعالیت لري ، کوم چې ممکن د cDNA محصول اوږدوالی اغیزمن کړي (د <4.5 kb ټیمپلیټونو لپاره مناسب). د دودیز برعکس نقل لپاره ، د TIANScript MMLV ریورس ټرانسکرپټیس سپارښتنه کیږي. دا RTase د خورا ضعیف RNase H فعالیت سره ترمیم شوی انزایم دی ، کوم چې د اوږد (> 5 kb) cDNA ترکیب لپاره مناسب دی.

د یو ګام ریورس ټرانسکرپشن او د PCR امپلیفیکیشن په ورته ټیوب کې بشپړ شوي پرته لدې چې د cDNA ترکیب او پراخیدو ترمینځ د ټیوب پوښ خلاص شي ، کوم چې د ککړتیا کمولو کې ګټور دی. لدې چې ترلاسه شوي ټول cDNA نمونې د پراخېدو لپاره کارول کیږي ، حساسیت لوړ دی ، لږترلږه 0.01 pg د ټول RNA سره. د یو مرحله بریالي RTPCR لپاره ، د جین ځانګړي پریمر عموما د cDNA ترکیب پیل کولو لپاره کارول کیږي. د دوه مرحلو میتود ، یعنی ریورس ټرانسکرپشن او د PCR پراخول په دوه مرحلو کې ترسره کیږي. لومړی د برعکس نقل د RNA ټیمپلیټ څخه د cDNA ترلاسه کولو لپاره ترسره کیږي ، او ترلاسه شوی CDNA د PCR یو یا ډیرو مختلف عکس العملونو سره مخ کیږي. د دوه مرحلو میتود کولی شي د اولیګو (dT) یا تصادفي پریمر وکاروي ترڅو د cDNA لومړي سټینډ ترکیب لارښود کړي ، او کولی شي د mRNA ټول معلومات له ځانګړي نمونې څخه نقل کړي.