د TIANSeq واحد-انډیکس اډاپټر (ایلومینا)

په اوسني وخت کې ، د لوړې کچې تسلسل ټیکنالوژي اساسا د راتلونکي نسل تسلسل ټیکنالوژۍ پراساس ده. لکه څنګه چې د راتلونکي نسل تسلسل ټیکنالوژۍ لوستلو اوږدوالی محدود دی ، موږ باید د بشپړ اوږدوالي تسلسل کوچني ټوټو کتابتونونو ته تسلسل ته مات کړو. د مختلف ترتیب کولو تجربو اړتیاو سره سم ، موږ معمولا د یو واحد پای ترتیب یا دوه ځله تسلسل غوره کوو. اوس مهال د راتلونکي نسل تسلسل کتابتون د DNA ټوټې عموما د 200-800 bp حد کې ویشل شوي.

الف) DNA په کیفیت کې ضعیف دی او مخنیوی کونکي لري. د لوړ کیفیت DNA نمونې وکاروئ ترڅو د انزیم فعالیت مخنیوي څخه مخنیوی وکړئ.

ب) د DNA نمونې اندازه ناکافي ده کله چې د DNA کتابتون جوړولو لپاره د PCR څخه پاک میتود وکاروئ. کله چې د ټوټه شوې DNA ننوتل له 50 ng څخه ډیر وي ، د PCR څخه پاک کاري جریان د کتابتون جوړولو پروسې په جریان کې په انتخابي ډول ترسره کیدی شي. که د کتابتون کاپي شمیره خورا ټیټه وي چې مستقیم ترتیب شي ، د DNA کتابتون د اډاپټر لیګیشن وروسته د PCR لخوا پراخه کیدی شي.

c) د RNA ککړتیا د DNA ناسم لومړني مقدار ورکولو لامل کیږي د RNA ککړتیا ممکن د جینومیک DNA پاکولو پروسې کې شتون ولري ، کوم چې ممکن د کتابتون جوړولو پرمهال د DNA ناسم مقدار او ناکافي DNA بارولو لامل شي. RNA کولی شي د RNase سره درملنه کولو سره لرې کړي.

A-1

a) کوچنۍ ټوټې (60 bp-120 bp) ښکاري کوچنۍ ټوټې معمولا د اډاپټر ټوټې یا ډیمرونه دي چې د اډاپټرونو لخوا رامینځته کیږي. د اجنکورټ AMPure XP مقناطیسي موزو سره پاکول کولی شي په مؤثره توګه د دې اډاپټر ټوټې لرې کړي او د تسلسل کیفیت ډاډمن کړي.

ب) د PCR پراخیدو وروسته په کتابتون کې لویې ټوټې څرګندیږي د اډاپټر تړل کیدو وروسته به د کتابتون DNA ټوټې اندازه 120 bp زیاته شي. که د اډاپټر لیګیشن وروسته د DNA ټوټه له 120 bp څخه ډیر شي ، دا ممکن د ډیر PCR پراخیدو غیر معمولي ټوټې پراخېدو له امله رامینځته شي. د PCR دورو شمیر کمول د وضعیت مخه نیسي.

c) د اډاپټر لیګیشن وروسته د کتابتون DNA ټوټو غیر معمولي اندازه پدې کټ کې د اډاپټر اوږدوالی 60 bp دی. کله چې د ټوټې دوه سرې اډاپټرونو ته وصل شي ، اوږدوالی به یې یوازې 120 bp زیات شي. کله چې د دې کټ لخوا چمتو شوي پرته بل اډاپټر وکاروئ ، مهرباني وکړئ له عرضه کونکي سره اړیکه ونیسئ ترڅو اړونده معلومات چمتو کړئ لکه د اډاپټر اوږدوالی. مهرباني وکړئ ډاډ ترلاسه کړئ چې د تجربې کاري جریان او عملیات په لارښود کې بیان شوي مرحلې تعقیبوي.

d) د اډاپټر لیګیشن دمخه د DNA ټوټې غیر معمولي اندازه د دې ستونزې لامل ممکن د DNA ټوټې کیدو پرمهال د غلط عکس العمل شرایطو له امله وي. د مختلف DNA وختونو لپاره باید د عکس العمل مختلف وختونه وکارول شي. که د DNA ان پټ له 10 ng څخه ډیر وي ، موږ وړاندیز کوو د 12 دقیقې عکس العمل وخت د اصلاح لپاره د پیل وخت په توګه غوره کړو ، او پدې وخت کې تولید شوي ټوټې اندازه اساسا د 300-500 bp حد کې ده. کارونکي کولی شي د خپلو اړتیاو سره سم د 2-4 دقیقو لپاره د DNA ټوټو اوږدوالی کم یا کم کړي ترڅو د اړین اندازې سره د DNA ټوټې مطلوب کړي.

A-2

الف) د ټوټې کیدو وخت مطلوب ندی که ټوټه شوی DNA خورا کوچنی یا خورا لوی وي ، مهرباني وکړئ د عکس وخت وخت ټاکلو لپاره لارښوونې کې ورکړل شوي د ټوټې کولو وخت انتخاب لارښودونو ته مراجعه وکړئ ، او د دې وخت نقطه د کنټرول په توګه وکاروئ ، سربیره پردې یو تنظیم کړئ د غبرګون سیسټم د 3 دقیقو اوږدولو یا لنډولو لپاره ترڅو د ټوټې کیدو وخت کې دقیق سمون راولي.

A-3

د ټوټې ټوټې درملنې وروسته د DNA غیر معمولي اندازې توزیع

الف) د ټوټې کیدو ریګینټ غلط تخم کولو میتود ، یا ریجینټ د ژړولو وروسته په بشپړ ډول نه مخلوط کیږي. په یخ باندې د 5 × فرګمنټیشن انزایم مکس ریګینټ پخه کړئ. یوځل چې خړوب شي ، ریبینټ په مساوي ډول د ټیوب لاندې ښکته کولو سره مخلوط کړئ. د ریجینټ څرخ مه کوئ!

ب) د DNA داخلي نمونه EDTA یا نور ککړونکي لري د DNA پاکولو مرحله کې د مالګې آئنونو او چیلاټینګ اجنټونو له مینځه وړل په ځانګړي توګه د تجربې بریا لپاره مهم دي. که DNA په 1 × TE کې منحل شي ، د ټوټې کولو ترسره کولو لپاره لارښود کې چمتو شوي میتود وکاروئ. که په حل کې د EDTA غلظت ناڅرګند وي ، نو سپارښتنه کیږي چې DNA پاک کړي او د راتلونکي عکس العمل لپاره یې په ډایونیز شوي اوبو کې منحل کړي.

c) د DNA لومړنی ناسم شمیرنه د ټوټه شوې DNA اندازه د DNA داخلي مقدار سره نږدې تړاو لري. د ټوټې کیدو درملنې دمخه ، د عکس سیسټم کې د DNA دقیق مقدار ټاکلو لپاره د Qubit ، Picogreen او نورو میتودونو په کارولو سره د DNA دقیق مقدار اړین دی.

 d) د عکس العمل سیسټم چمتو کول لارښوونې نه تعقیبوي د ټوټې شوي عکس العمل سیسټم چمتو کول باید د لارښوونو سره سم په یخ کې ترسره شي. د غوره اغیز ډاډ ترلاسه کولو لپاره ، د عکس العمل ټولې برخې باید په یخ کې کیښودل شي او د عکس العمل سیسټم چمتو کول باید د بشپړ یخیدو وروسته ترسره شي. د چمتووالي بشپړیدو وروسته ، مهرباني وکړئ فلیک یا پایپټ کړئ ترڅو په بشپړ ډول سره مخلوط شي. تاو مه کوئ!

1. د اختلاط ناسم میتود (بorه ، تاوتریخوالی ، او نور) به د کتابتون ټوټو غیر معمولي توزیع لامل شي (لکه څنګه چې لاندې عکس کې ښودل شوي) ، پدې توګه د کتابتون کیفیت اغیزه کوي. له همدې امله ، کله چې د فریمګینشن مکس عکس العمل حل چمتو کوئ ، مهرباني وکړئ د مخلوط کولو لپاره په نرمۍ سره پورته او ښکته پایپټ کړئ ، یا د ګوتو ټیپ وکاروئ او په مساوي ډول مخلوط کړئ. محتاط اوسئ چې د ورور سره ګډ نشي.

2. د لوړ پاکوالي DNA باید د کتابتون جوړولو لپاره وکارول شي

DNA د ښه DNA بشپړتیا: د الیکټروفورسیس بینډ له 30 kb څخه ډیر دی ، پرته له خولې

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. د DNA داخلي مقدار باید دقیق وي دا وړاندیز کیږي چې د DNA اندازه کولو لپاره د نوبت پرځای د Qubit او PicoGreen میتودونو څخه کار واخلي.

4. د DNA حل کې د EDTA مینځپانګه باید مشخص شي EDTA د ټوټې کیدو عکس العمل باندې لوی نفوذ لري. که د EDTA مینځپانګه لوړه وي ، د DNA پاکوالي ته اړتیا ده د وروستي ازموینې دمخه ترسره شي.

5. د ټوټې کیدو عکس العمل حل باید په یخ کې چمتو شي د ټوټې کیدو پروسه د عکس العمل تودوخې او وخت سره حساس وي (په ځانګړي توګه د اضافه کونکي اضافه کولو وروسته). د عکس العمل وخت دقت د ډاډ ترلاسه کولو لپاره ، مهرباني وکړئ په یخ کې د عکس العمل سیسټم چمتو کړئ.

6. د ټوټې کیدو غبرګون وخت باید دقیق وي د ټوټې کولو مرحلې عکس العمل وخت به مستقیم د ټوټو محصولاتو اندازه اغیزه وکړي ، پدې توګه په کتابتون کې د DNA ټوټو اندازې ویش اغیزه کوي.

1. په دې کټ کې کوم ډول نمونه د تطبیق وړ ده؟

د دې کټ پلي کیدونکي نمونې ډول کیدی شي د RNA ښه یا بشپړ RNA بشپړتیا سره پاک RNA وي. که ټول RNA د کتابتون جوړولو لپاره وکارول شي ، سپارښتنه کیږي چې لومړی د rRNA لرې کولو لپاره د rRNA تخفیف کټ (بلی#4992363/4992364/4992391) وکاروئ.

2. ایا د FFPE نمونې د دې کټ سره د کتابتون جوړولو لپاره کارول کیدی شي؟

د FFPE نمونو کې mRNA به تر یوې اندازې پورې تخریب شي ، د نسبي ضعیف بشپړتیا سره. کله چې د کتابتون جوړولو لپاره دا کټ وکاروئ ، دا سپارښتنه کیږي چې د ټوټې کیدو وخت مطلوب کړئ (د ټوټې کولو وخت لنډ کړئ یا د ټوټې کولو نه ترسره کول).

3. د محصول لارښود کې چمتو شوي د اندازې انتخاب مرحلې څخه کار اخیستل ، څه شی ممکن د داخل شوې برخې د لږ انحراف لامل شي؟

د اندازې انتخاب باید د دې محصول لارښود کې د اندازې انتخاب مرحلې سره په کلکه ترسره شي. که چیرې انحراف شتون ولري ، دلیل یې ممکن دا وي چې مقناطیسي مالګې د خونې تودوخې سره متوازن ندي یا په بشپړ ډول نه مخلوط شوي ، پایپټ درست ندی یا مایع په ټپ کې پاتې دی. سپارښتنه کیږي چې د تجربې لپاره د ټیټ جذب سره لارښوونې وکاروئ.

د کتابتون په جوړولو کې د اډاپټرونو انتخاب

د کتابتون ساختماني کټ کې اډاپټر ریجینټ شتون نلري ، او سپارښتنه کیږي چې دا کټ د TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378) سره په ګډه وکاروئ.

5. د کتابتون QC

د کتابتون کمیتي کشف: Qubit او qPCR په ترتیب سره د کتابتون ډله ایز غلظت او مولر غلظت ټاکلو لپاره کارول کیږي. عملیات په کلکه د محصول لارښود سره سم دي. د کتابتون غلظت به عموما د NGS تسلسل اړتیاوې پوره کړي. د کتابتون توزیع حد کشف کول: د کتابتون توزیع حد کشف کولو لپاره د Agilent 2100 Bioanalyzer کارول.

6. د پراخیدو دورې شمیره انتخاب

د لارښوونو مطابق ، د PCR دورو شمیره 6-12 ده ، او د اړتیا وړ PCR دورو شمیر باید د نمونې داخلې سره سم وټاکل شي. په لوړ حاصل لرونکي کتابتونونو کې ، ډیر لوړیدل معمولا په مختلف درجو کې پیښیږي ، کوم چې د Agilent 2100 Bioanalyzer په کشف کې د هدف حد څخه وروسته د یو څه لوی چوکۍ لخوا څرګندیږي ، یا د Qubit کشف شوي غلظت د qPCR په پرتله ټیټ دی. لږ پراخیدل یوه عادي پدیده ده ، کوم چې د کتابتون ترتیب او ورپسې ډیټا تحلیل اغیزه نه کوي.

7. سپیکس د Agilent 2100 Bioanalyzer د کشف پروفایل کې څرګندیږي

په اګیلینټ 2100 بایوانالیزر کشف کې د سپیکونو څرګندیدل د نمونو غیر مساوي ټوټې کیدو له امله دي ، چیرې چې په ځانګړي اندازه کې به ډیرې ټوټې وي ، او دا به د PCR بډای کیدو وروسته خورا څرګند شي. پدې حالت کې ، دا وړاندیز کیږي چې د اندازې انتخاب ترسره نکړئ ، د مثال په توګه د ټوټې کولو حالت 94 ° C ته د 15 دقیقو انکیوبیټ لپاره تنظیم کړئ ، چیرې چې د ټوټې ویش کوچنی او متمرکز دی ، او یووالي ښه کیدی شي.